The innovation | 曹鹏实验室揭示咳嗽的神经中枢环路机制

导读 ⭐

Introduction

2024年11月4日,北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院曹鹏实验室在《The innovation》上在线发表了题为“Brainstem opioid peptidergic neurons regulate cough reflexes in mice”的研究论文。该研究开发了一种崭新的三通道咳嗽行为范式,能同时监测小鼠胸膜内压(Intrapleural pressure,IPP),腔内气流(Boxflow)以及超声(Ultra sound),并区分出咳嗽和打喷嚏两种截然不同的呼吸道防御性反射,同时使用该行为范式,发现了小鼠孤束核(NTS)中的一群向呼吸中枢cVRG的谷氨酸能神经元投射的特异性的强啡肽能(Pdyn)神经元对咳嗽反射至关重要。

研究人员首先开发了一套可定量分析小鼠咳嗽的行为范式:通过使用全身体积扫描仪(whole-body plethysmography,WBP)、体内植入遥测装置、超声麦克风,可实时监测小鼠所在腔体的气流波动(Boxflow),胸膜内压(IPP)及细微声音变化(Sonogram)。在该系统中使用辣椒素诱导成功诱导出Class I 和Class II两种在声音频率、时长截然不同的气道防御性反射。由于NG和TG的神经末梢分别大量支配着喉部和鼻腔黏膜,研究人员随后使用化学遗传抑制病毒(hM4Di)分别/同时抑制支配呼吸道的NG和TG中的Trpv1⁺神经元,分别/同时抑制了Class I 和Class II反射, 并分辨Class I为咳嗽反射。

利用辣椒素刺激FosTRAP2小鼠, 研究人员定位到dorsal vagal complex(DVC)脑区响应辣椒素引发的生理性咳嗽,通过对NTS的FISH染色,发现3种啡肽类物质(强啡肽prodynorphin ,脑啡肽proenkephalin,内啡肽proopiomelanocortin)特异性表达在DVC,通过化学遗传抑制DVC中的Pdyn,Penk及Pomc神经元,其中,Pdyn⁺神经元抑制能显著减少辣椒素或柠檬酸引发的咳嗽。

同时,研究人员对Pdyn-Cre小鼠的NTS脑区注射AAV-DIO-GCaMP并包埋光纤,利用光纤记录手段,研究人员发现小鼠的呼吸与GCaMP信号存在偶联且咳嗽能大幅度引起Pdyn⁺ NTS神经元GCaMP信号上升,但是打喷嚏则对Pdyn⁺ NTS神经元GCaMP信号无明显影响,为了进一步确定Pdyn⁺ NTS神经元与咳嗽相关的GCaMP信号是否由外周的Trpv1⁺迷走神经传入,研究人员使用单侧迷走神经截断术或Trpv1-KO小鼠进行Pdyn⁺ NTS神经元的光纤记录实验,发现单侧迷走神经截断术或Trpv1的敲除,均能减弱咳嗽引发的Pdyn⁺ NTS神经元GCaMP信号的上升。从而确认了Pdyn⁺ NTS神经元接收来自Trpv1⁺ 迷走神经的信号输入并响应咳嗽。

为了进一步验证Pdyn⁺ NTS神经元的激活是否是引发咳嗽的充分条件,研究人员对Pdyn-Cre小鼠NTS脑区双侧注射了AAV-DIO-hM3Dq,使用化学遗传学手段激活Pdyn⁺ NTS神经元,结果表明,这群神经元的激活能有效引起咳嗽且不改变小鼠的呼吸速率,由此激发的咳嗽各类指标与辣椒素诱发的咳嗽一致。此外,研究人员对Pdyn-Cre 小鼠的NTS脑区注射AAV-DIO-ChR2并包埋光纤,光激活Pdyn⁺ NTS神经元同样能有效地诱发咳嗽。这些结果表明, Pdyn⁺ NTS神经元的激活对诱发咳嗽反射是充分条件。

为了探究Pdyn⁺ NTS神经元的下游通路,研究人员对Pdyn-Cre小鼠NTS脑区注射AAV-DIO-EGFP-Syb2,发现EGFP⁺ 的末梢主要出现在cVRG及同侧中间网状核(IRt) 。为确定Pdyn⁺ NTS-cVRG 和Pdyn⁺ NTS-IRt 在咳嗽反射中的作用,研究人员在Pdyn-Cre小鼠NTS脑区注射AAV-DIO-hM4Di并在cVRG或IRt包埋给药管,通过精准脑区递送CNO抑制来自Pdyn⁺ NTS的信号,结果发现Pdyn⁺ NTS-cVRG的抑制能有效减少辣椒素诱发的咳嗽,表明Pdyn⁺ NTS-cVRG环路功能对咳嗽反射是必要的。为进一步确定Pdyn⁺ NTS-cVRG环路在咳嗽反射的功能,研究人员对Pdyn-Cre小鼠的NTS注射AAV-DIO-ChR2并在cVRG包埋光纤,结果表明光激活NTS-cVRG的末梢能稳定地引发咳嗽反射,此外,作者对WT小鼠的cVRG注射AAV-ChR2-EYFP并包埋光纤,直接对cVRG的激活也能稳定地引发咳嗽反射。接下来，作者研究了Pdyn⁺ NTS cVRG通路是否与咳嗽相关肌肉通过突触连接。为了验证这一点，研究人员将AAV-DIO-EGFP-Syb2注射到Pdyn IRES Cre小鼠的DVC中，并将表达dsRed的伪狂犬病毒(PRV)注射到横膈膜、肋间肌和腹部肌三个肌肉群中,实现dsRed+神经元在几个大脑区域逆行标记。在cVRG中，dsRed+神经元与源自Pdyn⁺ NTS神经元的EGFP-syb2+轴突末梢相互分散。这些形态学结果表明，Pdyn⁺ NTS cVRG通路可能通过跨突触调节咳嗽相关肌肉,进而调控咳嗽反射。

综上所述,本研究开发了一种三通道监测的小鼠咳嗽行为范式,并以此范式,揭示了一条调控咳嗽反射的特异性环路: Pdyn⁺ NTS-cVRG;为后续咳嗽的深层神经机制研究奠定重要基础。

北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院曹鹏高级研究员为本文通讯作者。曹鹏实验室2022级TIMBR博士生卢海成,2022级PTN博士生郑文萱,博士后陈国庆,赵淼,谷华婷,黄美珠,首都医科大学硕士研究生李夏婷为本文共同第一作者。该研究得到北京市科委、清华大学生物医学交叉研究院以及北京生命科学研究所的资助。