Nature | 邵峰实验室与北京脑所罗敏敏实验室合作揭示GSDMD的激活是炎症性血脑屏障破坏的关键分子机制

导读 ⭐

Introduction

2024年04月17日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院的邵峰实验室，携手北京脑科学与类脑研究所的罗敏敏实验室，在Nature上共同发表了一篇题为Brain endothelial GSDMD activation mediates inflammatory BBB breakdown的研究论文。该项研究深入探讨了革兰氏阴性菌感染或LPS刺激下，脑内皮细胞中的caspase-4/11-GSDMD信号通路的活化导致了血脑屏障的炎症性破坏。这一发现不仅为理解血脑屏障在炎症状态下的破坏机制提供了新的视角，也为未来相关疾病的治疗策略提供了可能的靶点。

在模拟败血症的研究中，对小鼠进行单次腹腔注射LPS是一种广泛采用的方法3。研究人员发现，这种单次LPS处理能够触发野生型（Wild-type, WT）小鼠血脑屏障的破坏，然而，在Tlr4^-/-、Casp11^-/-或Gsdmd^-/-小鼠中，血脑屏障的破坏并未显著发生。同时，研究人员使用了不同分子量和化学特性的示踪剂染料（如~70-kDa Evans blue/albumin、44-kDa HRP、10-kDa TMR-dextran、443-Da sulfo-NHS-biotin）以评估血脑屏障的完整性，均一致地观察到了上述现象。鉴于小鼠Casp11的表达受到模式识别受体TLR家族介导的转录调控的影响，研究人员提出了一个大胆的假设：Tlr4 介导的Casp11转录激活，而非Tlr4介导的炎症因子上调，可能参与了LPS引起的血脑屏障破坏。为了验证这一点，研究人员在小鼠腹腔提前注射了Tlr3的激动剂poly(I:C)，以不依赖于Tlr4的方式诱导Casp11的表达。结果表明，在这种预处理条件下，即便是Tlr4^-/-小鼠，也能显著地响应LPS诱导的血脑屏障破坏；而Casp11^-/-或Gsdmd^-/-小鼠则没有表现出明显的血脑屏障破坏。此外，研究人员还使用了最为灵敏的小分子量示踪剂sulfo-NHS-biotin进行实验，发现在poly(I:C)预处理后，即使是低剂量的LPS刺激（2 mg kg-1），也能引起WT小鼠血脑屏障的有效破坏，而Casp11^-/-或Gsdmd^-/-小鼠则未受影响。同时，之前的研究报道，血液中的游离LBP蛋白以及游离或锚定在细胞膜表面的CD14受体，可能参与LPS的转移/内吞过程4。本研究进一步揭示，在Lbp^-/-或Cd14^-/-小鼠中，LPS诱导的血脑屏障破坏并未发生。这些发现强有力地指出，Casp11-Gsdmd信号通路是LPS导致血脑屏障破坏的关键因素，而Lbp-Cd14信号通路则可能在LPS的转运/内吞过程中发挥重要作用。

在后续的研究中，研究人员进一步确认了GSDMD在脑内皮细胞中的表达。通过对WT和Gsdmd^-/-成年小鼠运动皮层进行单细胞RNA测序分析，研究人员揭示了在LPS刺激后，脑内皮细胞在转录组水平上发生了明显变化，众多与炎症相关的基因表达水平在这些细胞中得到了显著增强。有趣的是，他们观察到，虽然脑内皮细胞本底不表达或低表达Casp11和Cd14；在LPS刺激下，Casp11和Cd14的表达也在脑内皮细胞中得到了显著上调。这一发现进一步暗示了脑内皮细胞的Lbp-Cd14以及Casp11-Gsdmd信号通路在LPS引起的血脑屏障破坏中的关键作用。

为了证实上述假设，在从小鼠脑皮层提取的血管组分、分离并培养的原代脑内皮细胞、以及永生化的人源脑微血管内皮细胞（hBMEC）中，研究人员均成功地检测到了LPS刺激引发的caspase-4/11激活和GSDMD的切割激活。特别值得注意的是，在诱导表达GSDMD的N端后，hBMEC表现出了显著的物质交换特性，这一现象发生在细胞裂解或细胞焦亡之前。这表明，适量的GSDMD-N端，在不必然导致细胞死亡的情况下，在细胞膜上形成的孔洞足以改变脑内皮细胞的通透性。为了在超微尺度上探究血脑屏障破坏的具体情况，研究人员利用透射电子显微镜对破坏区域进行了成像分析。图像结果显示，经历焦亡的脑内皮细胞呈现出凝聚的细胞核、皱缩的细胞质，同时内皮层与血管基底层的分离导致血管周围间隙的扩大。受损血管周围的脑实质区域也出现了一定程度的水肿现象。这些显著的微观结构变化，直观地揭示了血脑屏障破坏过程中细胞与组织的病理性改变。

随后，研究者们采用了由上海分子细胞卓越中心周斌团队开发的bEC-Cre（Tie2-Dre; Mfsd2a-CrexER）小鼠⁵以及由美国博德研究所Benjamin E. Deverman团队和哈佛大学顾成华团队共同开发的AAV-BI30-Cre腺相关病毒6，将它们分别引入Gsdmdflox/flox小鼠中。通过这两种方法，他们成功实现了在脑内皮细胞中特异性敲除Gsdmd的目标。经过这样的基因操作，两种小鼠模型均失去了对LPS诱导的血脑屏障破坏的敏感性。为了进一步验证这一发现，研究者们利用AAV-BI30腺相关病毒或由德国奥格斯堡大学附属医院Martin Trepel团队开发的AAV-BR1腺相关病毒7，在Gsdmd^-/-小鼠的脑内皮细胞中进行了特异性的回补实验。实验结果显示，只有当回补了野生型的GSDMD而非切割位点D276A突变型GSDMD时，Gsdmd^-/-小鼠才能重新获得对LPS诱导血脑屏障破坏的响应能力。这些实验结果得出了这样一个结论：脑内皮细胞的GSDMD是直接参与并介导LPS诱导的血脑屏障破坏过程的关键因素。

通过使用bEC-Cre; Ai14; Gsdmd^+/+小鼠，研究人员观察到，在受到LPS刺激并导致血脑屏障破坏的区域，那些显著丢失胞内tdTomato蛋白的脑内皮细胞，往往会大量累积血液循环中的sulfo-NHS-biotin示踪剂。然而，在bEC-Cre; Ai14; Gsdmd^flox/flox小鼠模型中，这种累积现象并未被观察到。进一步的实验表明，当在脑内皮细胞中直接表达GSDMD的N端片段时，可以清晰地观察到血脑屏障不依赖于LPS的破坏。

相较于人类，小鼠对LPS毒性表现出更强的耐受性。与小鼠的Casp11基因相比，人类的CASP4基因通常表现为组成性表达，能更敏感地识别LPS，以及可能具有更多的切割底物。这些特性可能是人类对LPS更为敏感的部分原因。在一项研究中，低剂量的LPS（5 mg kg^-1）直接诱发了CASP4转基因小鼠（CASP4^Tg小鼠）出现败血症/脓毒症的症状⁸。未进行poly(I:C)预处理的情况下，低剂量的LPS刺激（2 mg kg^-1）能够显著破坏CASP4^Tg小鼠的血脑屏障，而CASP4^Tg; Gsdmd^-/-小鼠则未表现出这种破坏现象。因此，CASP4人源化转基因小鼠对LPS显示出比野生型小鼠更高的敏感性，这使得它们成为模拟人类革兰氏阴性菌感染的理想模型。

在由革兰氏阴性菌引起的血液感染中，肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）是一种常见的机会性致病菌和院内感染菌。因为具有很强的耐药性，所以肺炎克雷伯菌对医院内的重症患者造成很大的健康威胁。本研究结果显示，在小鼠腹腔注射肺炎克雷伯菌能够破坏CASP4Tg小鼠的血脑屏障，而对CASP4^Tg;Gsdmd^-/-转基因小鼠则无此影响。这表明，在感染肺炎克雷伯菌的CASP4Tg转基因小鼠中，GSDMD的活化对于血脑屏障的炎症性破坏具有关键作用。在研究人员进一步利用AAV-BI30腺相关病毒在脑内皮细胞中特异性表达了GSDMD抑制性纳米抗体VHHGSDMD-1后9,10，结果发现，经过表达这种纳米抗体的CASP4Tg小鼠不再对肺炎克雷伯菌感染引起的血脑屏障破坏产生响应。这些发现强调了脑内皮细胞中GSDMD激活在革兰氏阴性菌感染和LPS刺激的血脑屏障破坏中的核心作用，并提示我们，抑制脑内皮细胞的GSDMD激活可能是维护血脑屏障完整性的有效策略。

综合上述研究成果，本项研究深入阐释了革兰氏阴性菌感染/LPS刺激如何破坏血脑屏障的分子与细胞生物学机制，并为非免疫细胞的GSDMD在病理过程中的重要作用提供了直接的实验证据。一方面，针对GSDMD的靶向激动剂设计，可能成为调节血脑屏障通透性的新策略，为跨血脑屏障递送中枢神经系统疾病治疗药物开辟了新的视野。另一方面，这一发现不仅丰富了我们对血脑屏障调控机制的认识，也为临床治疗提供了新的治疗靶点。通过开发针对GSDMD的靶向抑制剂，我们或许能够在革兰氏阴性菌感染患者需要时，为他们的血脑屏障提供有效保护，减轻中枢神经系统的损伤。

北京脑科学与类脑研究所罗敏敏实验室的副研究员韦超博士和北京生命科学研究所邵峰实验室的博士后蒋唯博士为本文共同第一作者。罗敏敏实验室的博士后王睿宇博士完成了该研究的单细胞RNA测序与分析的工作，对本论文有重大贡献。北京生命科学研究所的动物中心和电镜中心，以及北京脑科学与类脑研究所的动物中心、基因组学中心、光学影像中心和载体工程中心对本论文提供了帮助。罗敏敏博士和邵峰博士为该论文的共同通讯作者。该研究受国家重点研发计划项目、国家自然科学基金基础科学中心项目、中科院战略性先导科技专项、中国医学科学院医学创新单元、科技部科技创新2030-“脑科学与类脑研究“重大项目、北京市政府、以及腾讯新基石研究员项目资助，在北京脑科学与类脑研究所和北京生命科学研究所完成。

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https://www.nature.com/articles/s41586-024-07314-2