Science Advances | 郑三多实验室揭示KCTD介导GPCR脱敏的分子机制

G蛋白偶联受体(GPCR)被配体激活后，与G蛋白三聚体(α，β和γ亚基)结合，导致G蛋白三聚体解离为Gα亚基和Gβγ亚基，它们分别与下游不同的效应蛋白结合进行信号传递。GPCR的信号传递是一个级联放大的过程，为防止过度激活，细胞通过一系列机制及时下调各级信号放大器的效率，该负调控过程即是GPCR的脱敏(desensitization)。其中经典的脱敏机制是GRK/β-arrestin介导的受体内吞。近些年的研究发现KCTD家族蛋白可以通过调控Gβγ亚基介导GPCR的脱敏。

KCTD家族是一类在神经系统中高表达的蛋白，有超过20个成员，且与多种神经系统疾病以及神经系统发育异常相关。KCTD家族具有典型的双模块化结构域：N端高度保守的BTB结构域和C端多变的CTD结构域。大部分KCTD家族成员形成同源五聚体结构，通过它们的BTB结构域与Cullin-3和Rbx1蛋白形成特殊的五聚化E3泛素连接酶。然而KCTD8/12/16三个成员失去结合Cullin-3的能力，取而代之的是与GABAB受体结合，介导该受体的快速脱敏。郑三多等⁽¹⁾在2019年通过结构生物学手段发现KCTD8/12/16的BTB结构域形成开放的五聚体并锚定在GABAB受体的最C端，同时以五聚化的CTD结合5个拷贝的Gβγ蛋白，将其从效应蛋白GIRK钾离子通道上竞争下来，阻断其持续激活。有趣的是，虽然与KCTD8/12/16序列差异较大，KCTD2/5/17仍然具备结合Gβγ的能力，并通过E3泛素连接酶活性实现对Gβγ的泛素化降解⁽²⁾。KCTD2/5/17代表了一类新颖的针对Gβγ的脱敏机制，但是目前人们对于KCTD蛋白结合泛素化底物的分子机制仍然不清楚。

2023年7月14日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院郑三多课题组在Science Advances上在线发表题为"Structural basis for the ubiquitination of G protein βγ subunits by KCTD5/Cullin3 E3 ligase"的研究论文。该研究结合单颗粒冷冻电镜方法和生化、细胞验证，阐明了KCTD5招募Cullin3和Gβγ的分子机制，首次获得了Cullin3/KCTD一类五聚化的特殊E3泛素连接酶复合物的完整模型，提供了对该家族参与泛素化调控机制的基本认识。

果蝇KCTD2/5/17的同源蛋白INC的缺失突变导致果蝇睡眠时间减少将近一半，人源KCTD2和KCTD5可以回补果蝇睡眠表型。研究者发现KCTD2/5/17以及果蝇INC都可以通过CTD结构域结合Gβγ，此外人源KCTD5可以结合果蝇Gβγ的同源蛋白，说明KCTD2/5/17与Gβγ的相互作用界面在进化过程中非常保守。

为克服KCTD5与底物Gβγ之间瞬时、微弱的相互作用，研究者在KCTD5的最C端和Gγ蛋白的N端之间引入一段柔性肽段，以共价结合的方式增加了组分的相对浓度，从而获得了稳定的复合物，得到分辨率为3.3 Å的复合物结构(图1A)。结构显示KCTD5的CTD与Gβγ以5：5的化学计量比形成复合物。通过生化实验、体内降解实验以及KCTD5对cAMP积累的调控实验，研究者证实了KCTD5与Gβγ相互作用界面的合理性，并鉴定到多个对复合物形成关键的互作位点。KCTD5与Gβγ的这种结合方式与KCTD12和Gβγ之间完全不同：KCTD5和KCTD12结合在Gβγ亚基不同区域；结合在KCTD5上的5个Gβγ亚基以相对独立的方式与KCTD5结合，而在KCTD12上的5个Gβγ亚基之间相互作用，协同地与KCTD12结合 (图1A和1B)。这些特点支持了KCTD5作为E3泛素连接酶的一部分具有灵活的底物招募特点，以及KCTD12与Gβγ之间协同性结合保证可以快速将Gβγ亚基从GIRK离子通道竞争下来。

KCTD5和KCTD12招募Gβγ的特点。A, KCTD5 CTD与Gβγ复合物的冷冻电镜结构。B, KCTD12 CTD与Gβγ复合物的晶体结构⁽¹⁾。C, KCTD7 BTB与Cullin-3的冷冻电镜结构密度图。D, KCTD7的BTB结构域与Cullin-3的结构。

此外研究者解析KCTD7与Cullin 3的复合物结构，解释为什么有些KCTD蛋白不能结合Cullin-3 (图1C和1D)。以研究中获得的KCTD5/Gβγ和KCTD7/Cullin-3结构为参考，研究者最终搭建了包含E2-Ubiquitin、Cullin-3/Rbx1、KCTD5和Gβγ的酶-底物复合物模型(图2A和2B)，揭示了五聚化的KCTD5/Cullin-3如何将E2偶联的Ub快速转移到五个Gβγ亚基的泛素化位点上。此外研究者发现KCTD5通过泛素化降解Gβγ调控D1多巴胺受体下游cAMP的产生(图2C，2D和2E)。

Cullin-3/KCTD5/Gβγ E3泛素连接酶-底物完整复合物的模型。A和B, 包含Cullin-3、Rbx1、E2、Ub、KCTD5和Gβγ的完整复合物模型的俯视图(A)和侧视图(B)。E2的催化位点C85与Gβγ的泛素化位点(K23和K29)距离较近。C到E, KCTD5通过泛素化降解Gβγ减少GPCR下游cAMP的产生。

北京生命科学研究所与协和医学院联合培养的博士生蒋文通和北京大学联合培养的博士生王巍为该论文的共同第一作者，郑三多博士为通讯作者。该研究由科技部、北京市政府和清华大学共同资助，在北京生命科学研究所完成。

[1] Zheng S, Abreu N, Levitz J, Kruse AC* (2019). Structural basis for KCTD-mediated rapid desensitization of GABABB signaling. Nature. 567: (127-131).

[2] M. Brockmann et al., Genetic wiring maps of single-cell protein states reveal an off-switch for GPCR signalling. Nature . 546, 307-311 (2017).