Angew. Chem. | 刘臻课题组开发非天然苯胺合成酶（Aniline Synthase）

2025年4月7日，北京生命科学研究所 / 清华大学生物医学交叉研究院刘臻课题组在国际期刊《Angewandte Chemie International Edition》发表了题为“An Enzymatic Platform for Aniline Synthesis through Oxidative Amination”的研究论文。通过改造该实验室开发的黄素（FMN）依赖酶PtOYE（源自Parageobacillus thermantarcticus），这一催化体系可以有效地将胺类化合物和环己酮衍生物组合，通过氧化胺化的机制制备多种二级和三级苯胺。针对结构不同的胺类底物，作者分别通过两条定向进化路径获得了各自的优势突变体OYE_G3和OYE_M3，提高了酶催化的效率并抑制了环己酮直接脱氢生成苯酚的副反应。通过多组动力学实验，作者系统研究了这类苯胺合成酶的催化机制。实验表明，优势突变体不仅提高了亚胺中间体芳构化的催化效率，且降低了环己酮直接脱氢生成苯酚的活性，形成了有利于目标反应的协同效应。

苯胺类化合物的生物合成新策略

研究初期，作者首先对野生型黄素酶及其突变体的亚胺脱氢芳构化活性进行了系统性筛选。实验数据显示，课题组现有酶库中的OYE_G0突变体对于目标反应具有显著的初始活性，能够以最高的转化率（38%）催化生成目标产物3aa且目标产物与副产物4a的比例最优，体现了这类脱氢酶具有被进一步优化的潜力。

基于这一发现，研究人员随后利用OYE_G0作为起始模版，分别针对二级苯胺和三级苯胺的合成过程进行了多轮蛋白质工程化改造与筛选。通过多个活性位点的定点饱和突变以及随机突变，作者最终分别获得催化合成二级苯胺的突变体OYE_G3以及催化合成三级苯胺的优势突变体OYE_M3。

针对二级与三级苯胺分别开展的蛋白质工程化改造

在确定了最优酶突变体和最适反应条件之后，研究人员系统地研究了这些苯胺合成酶的底物适用范围。结果表明，这种生物催化方法展示出了良好的底物兼容性和官能团耐受性，可以将不同取代的苄胺、含杂环的伯胺以及部分烷基胺转化为相应的二级苯胺；也可成功地将部分仲胺转化为三级苯胺。此外，不同取代模式的环己酮也能参与反应。在此基础上，作者选取多个底物进行了制备规模的酶促反应，成功合成出如3ad、3ao等多种苯胺衍生物，进一步验证了该方法的应用潜力。

底物适用性拓展与部分放大试验

为了深入了解这一酶促反应的机理，作者对生物催化脱氢偶联反应进行了一系列动力学研究。首先，研究人员使用二级苯胺合成酶进化谱系中的各个变体针对3aa的酶催化合成进行了时间进程实验，并通过Michaelis-Menten曲线分析酶的动力学参数。实验结果表明定向进化引入的突变有效地提高了苯胺合成酶OYE_G3的k_cat。随后，作者用类似的方法对三级苯胺3ca的合成反应进行了时间进程研究。与二级苯胺合成体系不同是，三级苯胺合成反应的前期会发生可逆的aza-Michael加成过程形成中间体6b，因此反应会显示出明显的诱导期（induction period）。为了明确探究酶活性是否从环己酮脱氢转移到亚胺脱氢，作者比较了最初变体（OYE_G0）与定向进化谱系的两个最终变体（OYE_G3和OYE_M3）生成苯酚的活性变化（图4e和4f）。实验结果表明，进化后的变体对于苯酚生成过程的催化能力显著下降。

苯胺合成酶系统的动力学研究

酶催化苯胺合成反应的推测过程

基于黄素依赖酶的独特脱氢催化机制，作者开发了非天然的苯胺合成酶系统，可以有效地制备二级与三级苯胺衍生物。这种酶催化系统可以通过后续的进化进一步提高催化效率，并通过计算与实验结合的方式完善机制研究。总体而言，这项工作为苯胺化合物的合成提供了高效、环境友好的生物合成策略，在生物催化和药物开发等领域具有重要的应用前景。

本项目的实验部分主要由刘臻实验室北师大学籍研究生赵翔完成。本研究得到科技部、清华大学生物医学交叉研究院以及北京生命科学研究所的资助。