何新建实验室和南方科技大学杜嘉木实验合作研究发现ISWI染色质重塑复合体的植物亚基调控开花时间的分子机制

2020年4月30日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院何新建实验室和南方科技大学杜嘉木实验室合作研究在《Plant Cell》杂志在线发表了题为“Dual recognition of H3K4me3 and DNA by the ISWI component ARID5 regulates the floral transition in Arabidopsis”的研究论文。该研究鉴定了ISWI染色质重塑复合体的植物特异亚基，揭示了其通过结合DNA及组蛋白H3K4me3修饰调控开花时间的分子机制。

染色质重塑因子是调节染色质状态的重要因子，通过水解ATP产生的能量调节核小体的组装、移动、替换和剔除，从而影响DNA的复制、修复及基因表达等。ISWI是真核生物中一类保守的染色质重塑因子，主要通过介导核小体的移动使核小体的在基因区域呈均匀排布状态，从而调控基因转录。 在动物和酵母中，ISWI染色质重塑因子通常与1-3个辅助亚基结合形成多种蛋白复合体。模式植物拟南芥中的研究表明，其包含两个功能冗余的ISWI染色质重塑因子CHR11 和CHR 17，但是对ISWI染色质重塑复合体其它亚基的报道仅限于一类包含DDT结构域的蛋白家族。拟南芥中的ISWI复合物是否包含其它亚基？这些亚基如何在复合物中发挥作用？这些问题还有待研究。

何新建实验室通过对拟南芥中的ISWI复合体进行系统研究，发现拟南芥的ISWI染色质重塑复合体主要包括三种类型，将其命名为CRA（CHR11 / 17-RLT1 / 2-ARID5），CDM（CHR11 / 17-DDP1 / 2 / 3-MSI3）和CDD（CHR11 / 17） -DDR1 / 3/4/5 / DDW1）（图1A, 1B）。其中的CRA型ISWI复合体包含一个植物特异亚基，命名为ARID5。 以往的研究表明，chr11/17突变体及rlt1/2突变体植物变小，育性下降，开花时间提前，其中chr11/17突变体的表型更强。该研究发现，arid5突变体的发育与开花时间表型与rlt1/2突变体相似，这证明了ARID5与其所在复合体其它亚基的功能相关性。RNA-seq分析发现，ARID5与CRA型ISWI复合体的其它亚基共同调控了多个关键开花时间调节基因的表达水平，表明该复合体各亚基可能通过共同调控这些基因的表达影响开花时间。

图1.拟南芥ISWI复合体的鉴定。（A）通过IP-MS检测到的三个亚型的ISWI复合物的亚基的蛋白质-蛋白质相互作用网络。（B）通过Y2H分析检测到的ISWI复合物亚基的蛋白质-蛋白质相互作用网络。

ARID5包含一个推测的ARID结构域和与其相邻的PHD结构域。利用生化和蛋白研究方法发现，ARID5的ARID结构域能够结合双链DNA；与其相邻的PHD结构域特异识别组蛋白修饰 H3K4me3而不识别未修饰的组蛋白或其它修饰的组蛋白（图2A-2C）。通过与南方科技大学的杜嘉木实验室的合作研究，发现ARID5蛋白的ARID-PHD双结构域能够协同作用结合H3K4me3及包含AT的DNA（图2D,2E），得到了ARID-PHD、DNA、H3K4me3形成的三元复合体，解析了其高分辨率的晶体结构 （图3A-3E)。结构分析发现，ARID5的PHD结构域中的Trp688和Trp697形成的笼状结构负责与H3K4me3的三甲基赖氨酸的特异结合，另外其PHD和ARID能够通过氢键与H3K4 周围的氨基酸残基结合，从而增强ARID5与H3K4me3组蛋白肽段的结合（图3A-3E）。ARID主要与DNA骨架上磷酸基团结合，另外ARID的T648能够通过氢键与DNA识别位点中央的AT碱基结合，这揭示了ARID识别富含AT碱基的DNA的分子机制。

图2. ARID5与DNA及H3K4me3组蛋白的结合能力测定。（A,B）EMSA检测ARID5与含AT碱基的DNA1和DNA2结合。（C）利用pull down检测ARID5与H3K4me3的结合。（D）通过ITC检测ARID5的ARID-PHD区域与DNA的结合能力。（E）利用ITC检测ARID5的ARID-PHD区域与H3K4me3组蛋白的结合能力。

图3. ARID5的ARID-PHD区域与H3K4me3组蛋白肽段和DNA结合的结构分析。（A,B）ARID5的ARID-PHD区域与H3K4me3和DNA结合的总体结构。（C）ARID和PHD域之间的相互作用。相互作用残基突出显示，氢键以虚线表示。（D,E）AIRD5与H3A1，H3R2（D），H3K4me3，H3Q5和H3T6（E）的相互作用。相互作用的残基在图中突出显示，氢键以虚线表示。

利用ChIP-seq分析，发现野生型ARID5主要分布在染色质上富集H3K4me3修饰的基因的转录起始位点以及其后区域（图4A），所结合的区域富含AT碱基，而ARID和PHD功能缺失的ARID5与染色质的结合能力显著降低。通过遗传互补分析发现，野生型ARID5转基因能完全互补arid5突变体发育和开花时间缺陷表型，而ARID和PHD缺失或突变后，ARID5转基因不能互补arid5突变体的表型（图4B），这表明ARID与PHD结构域是ARID5行使正常的生物学功能所必需的。这表明，ARID5的ARID与PHD结构域通过负责介导ARID5与染色质结合行使其参与发育和开花时间调控的生物学功能。ChIP-PCR分析发现， ISWI染色质重塑复合体的催化亚基CHR11能够结合ARID5所在染色质位置，而当ARID5缺失后，CHR11与该染色质位置的结合能力显著降低。

图4. ARID5结合组蛋白修饰H3K4me3富集基因区域调控开花时间。（A）ARID5富集基因上的ARID5和H3K4me3信号的平均分布模式。（B）WT，arid5以及在arid5背景下表达ARID5-WT，ARID5-ΔPHD和ARID5-ARID-M的转基因植物的形态。

这些结果表明，ARID5通过ARID和PHD结构域与染色质特定位置结合，并通过这种方式增强其所在的ISWI复合体与染色质的结合能力，从而调控其靶基因的转录水平。该研究发现了植物中ISWI染色质重塑复合体的特异亚基，并揭示了植物ISWI复合体与H3K4me3及富含AT的DNA结合的分子机制，为理解ISWI复合体调控开花时间的机制提供了分子证据。

我所何新建实验室的博士生谭连美和南方科技大学的博士后刘瑞是该论文的共同第一作者。何新建博士和南方科技大学的杜嘉木博士为该论文的共同通讯作者。该研究得到了科技部、国家自然科学基金委、北京市政府及深圳市政府的资助。