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科研进展

2018年11月08日，我所张昱实验室在《Genome Biology》杂志在线发表题为“构建dCas9-EGFP小鼠并首次在活体动物中实现基因组特定位置的实时追踪 ”的文章。(https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-018-1530-1)

发布时间：2018/11/09

CRISPR/Cas9 技术正成为几乎所有模式生物研究中最热门的工具之一。依赖于guide RNA （gRNA）与目标序列的互补配对，CRISPR/Cas9系统能精确地实现对靶序列的识别与编辑。先前，大多数科学工作的开展主要针对于CRISPR/Cas9系统的精确靶向和切割。目前，通过将Cas9蛋白切割活性的失活，只保留其结合基因组的活性，再与各种效应蛋白融合，愈来愈多的研究也将CRISPR/Cas9系统运用于表观遗传调控以及标记活细胞中特定的基因组位点。例如，dCas9/gRNA复合物与转录激活因子或者抑制因子融合，可以导致gRNA靶向的基因转录激活或者抑制。与表观遗传调控相关的蛋白的融合也可导致靶向序列的表观遗传变化，例如DNA甲基化/去甲基化、组蛋白修饰以及染色质重塑。此外，也有研究将dCas9/gRNA复合物与DNA脱氨酶融合导致靶向基因组序列的精确核苷酸突变。在活细胞基因组标记成像方面也已开发了各种基于dCas9/gRNA的标记系统，主要通过将荧光蛋白募集到靶基因组区域来实时跟踪染色质区域的运动。

到目前为止，dCas9/gRNA工具主要通过转染或病毒感染的方法将dCas9,gRNA以及相应的效应蛋白导入体外培养的细胞中。然而， dCas9/gRNA在活体动物中的体内应用仍然受到较多限制，如何有效地将所有这些组分，尤其是大的dCas9表达质粒送到各种组织的细胞中仍然是一个主要的困难。为了解决这一问题，张昱实验室研究人员构建了全身表达dCas9-EGFP的小鼠（Figure 1）。通过该小鼠，研究人员首次观察并记录了活体动物中端粒的动态。张昱实验室研究人员还开发了CRISPRimaging-interference (CRISPRii)系统，实现了在活体动物体内抑制TRF1表达的同时，记录端粒位点的动态（Figure 2），通过该系统，研究人员观察到抑制TRF1（一种shelterin蛋白）的表达会显著地影响端粒动态变化，这与以往报道一致，并且该表型可以被过表达TRF1恢复。

Figure 1.dCas9-EGFP Rosa26 Knock-in载体示意图

Figure 2. CRISPR imaging and interference (CRISPRii)系统示意图

令人意外的是，通过比较小鼠体内细胞与体外培养细胞系的端粒动态，研究人员发现体内与体外两种状态下端粒的动态显著不同（Figure 3）。这也提示了体内研究的必要性。本研究首次将dCas9/gRNA标记系统运用于活体动物中，为后续在活体动物体内研究染色3D结构及动态变化提供了重要工具。

Figure 3. 小鼠活体肝脏细胞与细胞系的端粒运动特征显著不同

张昱实验室段金志、芦广庆、洪煜和胡庆涛为该论文共同第一作者，其他作者还包括张昱实验室麦雪莹、郭靖、司晓芳以及转基因动物中心王凤超博士。张昱博士为本文通讯作者。该研究由国家自然科学基金（81572795和81773304）和北京市政府“百千万人才计划”支持，在北京生命科学研究所完成。胡庆涛博士由国家自然科学基金资助（31701135）。